小分子藥物因為其可口服的高便利性，易吸收、易穿透細胞膜的高可成藥性，成為現(xiàn)代藥物開發(fā)的基石。但傳統(tǒng)的小分子藥物采用的是“占位驅動"模式來抑制蛋白功能，導致包括受體、激酶及通道類型等靶點在內的基因僅有約400種可作目標藥物，而已知的可成藥的基因約3000種。因此，“事件驅動"模式蛋白降解靶向嵌合體（Proteolysis-Targeting Chimera, PROTAC）技術為新藥研發(fā)提供了新思路，并成為新藥研發(fā)的一大利器。

一、蛋白降解靶向嵌合體簡介

PROTAC是一種異雙功能分子，結構由兩個配體通過Linker連接而成，其中一個配體可結合目標蛋白（Protein of interest, POI），另一個配體可以靶向E3連接酶。其本質是存在于所有真核生物中的天然蛋白降解機制——泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-Proteasome Pathway, UPP）。該途徑涉及一個三酶級聯(lián)反應，即泛素分子在泛素激活酶（E1）、泛素結合酶（E2）及泛素連接酶（E3）等系列酶作用下，將細胞內蛋白質分類并選中靶蛋白，并對靶蛋白進行特異性修飾，最終形成靶蛋白多聚泛素鏈并被蛋白酶體識別和降解。其中，E1激活酶和E2結合酶參與的過程稱為泛素的激活，單獨的泛素本身并沒有任何生物功能，只是一種分子標記蛋白，發(fā)揮作用的前提是必須有ATP來提供能量。

圖片來源：Autophagy and the ubiquitin-proteasome system: collaborators in neuroprotection.

因此，PROTAC是一種“事件驅動"的模式，即它可以和靶蛋白任何位置結合，且不需要高親和力，就可以誘導靶蛋白降解。PROTACA分子在進入細胞后，其目標蛋白配體可特異性結合靶蛋白，另一端可募集E3連接酶，最終形成POI-Linker-E3 Ligase三元復合物，拉近E3連接酶和靶蛋白的距離，從而誘導E3連接酶為靶蛋白貼上泛素標簽，繼而促進靶蛋白的降解。隨著靶蛋白降解而掉落下來的PROTAC分子可繼續(xù)被循環(huán)利用。

圖片來源：Discovery of a first-in-class CDK2 selective degrader for AML differentiation therapy

二、蛋白降解靶向嵌合體體外研究難點

盡管PROTAC因其獨·特作用機制具有突破性的優(yōu)勢，但PROTAC分子的開發(fā)仍面臨大量挑戰(zhàn)。

口服給藥是大多數(shù)疾病治療的理想給藥方式，但PROTAC由于其獨·特的分子結構并不滿足“分子量小于500；氫鍵供體數(shù)目小于5；氫鍵受體數(shù)目小于10；脂水分配系數(shù)小于5和可旋轉鍵的數(shù)量不超過10個"的經(jīng)典小分子藥物類藥五原則。PROTAC分子量通常在600~1200 Da之間，一般可達到700 Da以上，且一般伴有溶解性較差、體內外滲透性表現(xiàn)不佳，口服生物利用度通常偏低及吸收較差等情況。

此外，相較于暴露量越多越好的傳統(tǒng)小分子藥物來說，PROTAC由于結構的復雜性，具有新的挑戰(zhàn)。通常，在合適的或相對較低的濃度下，PROTAC可誘導靶蛋白和E3連接酶形成“靶蛋白PROTAC-E3連接酶"三元復合物；然而，當濃度過高時，就易競爭性地出現(xiàn)“靶蛋白-PROTAC"或“E3連接酶-PROTAC"等二元復合物，即“鉤子效應"，導致藥效降低甚至出現(xiàn)毒性積累。因此，適時地調整PROTAC劑量對于靶向治療至關重要。

目前現(xiàn)有研究表明PROTAC分子在各種屬中均呈現(xiàn)較高的血漿蛋白結合狀態(tài)，常規(guī)的血漿蛋白結合試驗可能無法準確的體現(xiàn)其血漿蛋白結合率，而血漿蛋白結合率的測定是必須的。血漿蛋白結合試驗可測定化合物在血漿中的穩(wěn)定性，以防止化合物在高血漿蛋白結合率的情況下出現(xiàn)藥物代謝過緩并導致化合物不被清除的現(xiàn)象。同時，PROTAC分子本身結構特殊，分子量大，為提高其滲透性與溶解度，在藥物設計時往往需要引入雜原子，且Linker部分在代謝層面其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生可能發(fā)生藥物毒性作用或藥效不足的現(xiàn)象，因此，對PROTAC分子代謝產(chǎn)物的鑒定至關重要。

而根據(jù)《藥物相互作用研究技術指導原則》，了解轉運體介導的藥物相互作用也是評價體外藥代動力學的重要內容之一。早期常采用Caco2細胞、高表達BCRP細胞或高表達BCRP膜囊泡進行體外評估，然而由于PROTAC分子結構的特殊性，其滲透性一般較差，采用完整的細胞結構可能低估PROTAC分子對外排轉運體的抑制作用。

綜上所述，對PROTAC分子進行體外DMPK研究至關重要，然而，目前尚無定項針對PROTAC藥物研究的指導原則，因此，在實際研究中，研究者往往會參照小分子藥物研究的指導原則。

三、PROTAC體外研究策略

盡管PROTAC是一種暫無指導原則的新興小分子藥物，但它“事件驅動模式"的功效性促使藥物研發(fā)領頭軍們對其展開了孜孜不倦的研究。目前國內部分藥企對PROTAC分子藥物的開發(fā)已接近國際水平并達到了臨床階段。

圖片來源：clinicaltrials, chinadrugtrials,太平洋證券整理

目前常規(guī)檢測化合物的溶解度通常是利用PH 7.4的磷酸緩沖液，但已有研究報道PROTAC分子在不同狀態(tài)下（禁食/非禁食）的腸液中其溶解度顯著不同，即在腸液中PROTAC分子溶解度相對更高，且非禁食狀態(tài)下的溶解度效果優(yōu)于禁食狀態(tài)的腸液。針對滲透性研究，PROTAC分子的研究遵循了常見的體外模型結構，即可利用Caco2、MDCK和LLC-PK1等模型。

而為防止“鉤子效應"、確定血漿蛋白結合率和代謝產(chǎn)物等情況，對PROTAC分子進行體外代謝研究是至關重要的！PROTAC分子體外DMPK研究一般也遵循小分子藥物的研究方式，即了解PROTAC藥物的代謝關鍵酶、選擇合適的體外模型及測定其血漿穩(wěn)定性等。

確定代謝關鍵酶

對PROTAC進行體外藥代動力學研究，除了基本的I相（CYP酶）代謝和II相（UGT酶）代謝，已有報道發(fā)現(xiàn)醛氧化酶（Aldehyde oxidase, AOX）可參與PROTAC分子的代謝，但存在明顯的種屬差異，需要多種屬驗證確保數(shù)據(jù)真實性。

全血/血漿穩(wěn)定性試驗

作為體外藥代動力學早期研究的試驗之一，全血中含有豐富的水解酶類，可催化藥物的水解代謝，且根據(jù)經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，全血中不穩(wěn)定的化合物一般含有酰胺鍵、磺酰胺鍵、肽鍵及酯鍵等官能團，由此可進一步推斷導致PROTAC在全血中不穩(wěn)定性的位置的可能性。

血漿蛋白結合率測定

已知PROTAC分子在各種屬中均呈現(xiàn)較高的血漿蛋白結合狀態(tài)，所以對其進行種屬間比較或體外-體內外推（in vitro-in vivo extrapolation, IVIVE）時需充分考慮化合物在孵育體系中的游離率和全血中游離率數(shù)據(jù)。

常見的體外代謝研究模型如下：

鑒于PROTAC分子溶解性對外排轉運體研究的影響性，采用高表達BCRP膜囊泡模型更具說服力，即膜囊泡可使ABC轉運體的底物結合位點暴露于細胞外緩沖液中，更適用于研究候選藥物作為底物和抑制劑與ABC轉運體的相互作用。

四、IPHASE體外DMPK研究“一站式"產(chǎn)品解決方案

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參考文獻:

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[5] 《藥物相互作用研究技術指導原則》。

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