Keywords：Microsomes, Phase Ⅱ Metabolism; Hepatocytes; UDPGA; UGT; Drug Metabolism; Phase Ⅰ Metabolism

藥物代謝（Drug Metabolism）研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關(guān)系。由于肝臟是藥物代謝的主要場(chǎng)所，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ)。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體（Liver Microsomes）體外溫孵法、重組P450酶（Recombinant P450 Enzyme）體外溫孵法、肝細(xì)胞（Hepatocytes）體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體與肝細(xì)胞體外溫孵法較其它方法而言，制備簡(jiǎn)單，代謝過(guò)程快，重現(xiàn)性好，易大量操作，可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實(shí)際工作中應(yīng)用較為普遍。

一、藥物的Ⅱ相代謝反應(yīng)

藥物代謝是指藥物在體內(nèi)發(fā)生的化學(xué)變化，導(dǎo)致藥物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，也被稱為藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化。肝臟是藥物代謝的主要器官，藥物在肝內(nèi)藥物代謝酶的作用下經(jīng)過(guò)不同程度的結(jié)構(gòu)變化，即I相代謝反應(yīng)（Phase I Metabolism）和II相代謝反應(yīng)（Phase II Metabolism）。其中，Ⅱ相代謝（Phase Ⅱ Metabolism），又稱結(jié)合反應(yīng)，指Ⅰ相代謝產(chǎn)物或原型藥物在酶的影響下與內(nèi)源性小分子（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）結(jié)合或經(jīng)甲基化、乙酰化排出體外。藥物的結(jié)合反應(yīng)，常常使其轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的代謝物，且極性增加，以便藥物排出體外。

在藥物的Ⅱ相代謝中，葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要、最-普遍的結(jié)合反應(yīng)，而該類型的發(fā)生通常需UGT來(lái)介導(dǎo)。UGT家族是人體內(nèi)僅次于CYP450家族的第2大藥物代謝酶。UGT催化的葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）為葡萄糖醛酸的供體將一分子的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移到含有羥基、羧基、氨基、巰基以及酸性碳原子等基團(tuán)的脂溶性小分子底物上。葡萄糖醛酸和小分子底物的結(jié)合使這些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，進(jìn)而更容易被排出體外。

UGT介導(dǎo)的葡萄糖醛酸結(jié)合代謝不僅會(huì)顯著影響藥物的口服生物利用度和藥物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，同時(shí)還與一些臨床藥物-藥物相互作用、藥物-草藥相互作用、藥物-食物相互作用，以及高膽紅素血癥、癌癥、自身免疫性肝炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，合理的體外代謝模型于研究藥物的二相代謝反應(yīng)具有重要意義。目前，常使用的體外代謝模型有肝微粒體（Liver Microsomes）和肝細(xì)胞（Hepatocytes）兩種。

二、肝微粒體體外溫孵法

微粒體（Microsomes）是指在細(xì)胞勻漿和差速離心過(guò)程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，是異質(zhì)性的集合體。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分，在體外實(shí)驗(yàn)中具有蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)糖基化和脂類合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能，廣泛存在于肝臟等多個(gè)器官中，主要為I相細(xì)胞色素CYP450酶（Cytochrome P450）和II相酶系UGT等，囊括了多種類型藥物的不同代謝途徑。

2.1肝微粒體體外孵育體系的建立

Ⅱ相代謝穩(wěn)定性（Phase II Metabolic Stability）研究的肝微粒體體外孵育體系，是由肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，由微粒體中的糖醛酸轉(zhuǎn)移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進(jìn)行生化反應(yīng)的體系。

推薦的孵育體系為：每個(gè)孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液（0.1M PBS），NADPH再生系統(tǒng)（1.3mM NADP，3.3mM的6-磷酸葡萄糖，0.4U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂，0.05mM 檸檬酸鈉），UGT孵育系統(tǒng)（5mM UDPGA，5mM D-葡萄糖二酸-1.4-內(nèi)酯，50μg/mg蛋白的丙甲菌素），0.1 mg/mL~1 mg/mL肝微粒體蛋白，合適濃度的待測(cè)物，于37°C水浴孵育。每個(gè)樣品平行3次，將待測(cè)物換為7-羥基香豆-素，作為陽(yáng)性對(duì)照；陰性對(duì)照組分三組：a.只加UDPGA；b.不加UDPGA，用0.1M PBS緩沖液替代，理論上不代謝；c. 只包含受試物和0.1M PBS緩沖液。于預(yù)設(shè)的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，如0,2,5,10,15,30,60 min后加入等體積預(yù)冷的乙腈終止反應(yīng)。

2.2 IPHASE肝微粒體II相代謝穩(wěn)定性研究

為驗(yàn)證孵育體系的適用性，IPHASE以蛋白濃度為0.5mg/ml 的lot number 為23H018猴肝微粒體為體外孵育模型，驗(yàn)證終濃度為100μM的陽(yáng)性藥物7-羥基香豆-素在體外的穩(wěn)定性，并利用色譜峰面積作為計(jì)算數(shù)據(jù)。即通過(guò)時(shí)間點(diǎn)占初始點(diǎn)百分比的回歸曲線計(jì)算確定化合物體外的半衰期。將受試物的零時(shí)濃度作為100%，2,5,10和30min各時(shí)間點(diǎn)濃度與零時(shí)濃度相比得剩余百分?jǐn)?shù)，各時(shí)間點(diǎn)的底物剩余百分?jǐn)?shù)的自然對(duì)數(shù)與孵育時(shí)間經(jīng)線性回歸，最終求得斜率k。最終再由計(jì)算公式可進(jìn)一步得到半衰期和清除率結(jié)果。

整個(gè)孵育體系如下：

結(jié)果如下：

半衰期=5.49 min；清除率=1263 uL/mg/min

除微粒體外，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)S9和胞質(zhì)液也常用于藥物的代謝輪廓研究。前者包含了完整的I相和Ⅱ相代謝酶的活性其孵育體系類似于微粒體，但其CYP450酶和UGT酶的純度較微粒體而言略低，因此S9可用于非主要酶系代謝的體外研究模型之一；后者包含了可溶性的Ⅱ相代謝酶，如NAT、GST、ST、TPMT等，在很多化療藥物的激活與解毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用，由于該體系中只有Ⅱ相代謝酶存在，且相對(duì)于肝S9來(lái)講酶活還很高，因此可通過(guò)加入不同的輔酶來(lái)單獨(dú)研究某個(gè)亞型酶的代謝。

三、肝細(xì)胞體外溫孵法

除了肝微粒體，原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）也是II相代謝穩(wěn)定性試驗(yàn)研究的常用體外模型工具之一。相較于肝微粒體這類亞細(xì)胞結(jié)果，原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細(xì)胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結(jié)合酶【如細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶，為滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的還原酶】，也包括胞質(zhì)酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此，原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認(rèn)為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn)，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。

鑒于此，IPHASE用Lot number為K0125A051的小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行體外肝細(xì)胞孵育體系的驗(yàn)證。IPHASE技術(shù)人員將細(xì)胞密度為0.5 million cells/mL的肝細(xì)胞同終濃度為1uM的陽(yáng)性藥物米達(dá)唑侖共同孵育，于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中分別培育0、5、30min下藥物的剩余量，由此得出藥物的半衰期及清除率，符合IPHASE長(zhǎng)久以來(lái)積累的歷史數(shù)據(jù)范圍值。因此，IPHASE原代肝細(xì)胞具有活性高、批次間穩(wěn)定性差異小及純度高等優(yōu)勢(shì)！

結(jié)果為：半衰期=5.11 min；清除率=271 uL/mg/min

綜上所述，II相代謝穩(wěn)定性試驗(yàn)研究在藥物研發(fā)中至關(guān)重要，可幫助評(píng)估代謝途徑、預(yù)測(cè)清除率、優(yōu)化藥物設(shè)計(jì)、評(píng)估相互作用、支持臨床試驗(yàn)、確保安全性，并滿足法規(guī)要求，因此，選擇合適的產(chǎn)品及體外孵育系統(tǒng)對(duì)該試驗(yàn)研究至關(guān)重要！

四、IPHASE產(chǎn)品

因此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，為滿足不同客戶的需求，深耕細(xì)作，研發(fā)生產(chǎn)出多種屬、多品系的肝微粒體和肝S9，并提供相應(yīng)II相代謝穩(wěn)定性研究的配套試劑，并嚴(yán)格質(zhì)控，致力于為客戶提供最-優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。

IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢(shì)：

合規(guī)性 生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得，來(lái)源清晰。

安全性 生產(chǎn)組織均經(jīng)過(guò)病原檢測(cè)，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。

高質(zhì)量 生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控，且同批次數(shù)量多，批次間差異性小。

可定制 可根據(jù)客戶特殊需求，提供特殊種屬、特殊組織產(chǎn)品的定制服務(wù)。

高服務(wù) 高質(zhì)量的售后服務(wù)，為試驗(yàn)順利保駕護(hù)航。

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，推出了多領(lǐng)域、多種類的高-端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學(xué)品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品，望廣大科研工作者咨詢。

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